Metoda-metoda didalam Mikroteknik

MIKROTEKNIK

Mikroteknik merupakan ilmu atau seni mempersiapkan organ, jaringan atau bagian jaringan untuk dapat diamati dan ditelaah. Penelaahan umumnya dilakukan dengan bantuan mikroskop, karena struktur jaringan secara terperinci pada galibnya terlalu kecil untuk dapat dilihat dengan mata telanjang. Ruang lingkup yang mencakup materi mikroteknik dapat diperoleh dari sejumlah definisi dan peristilahan yang bisa dipakai, hanya saja sebaiknya kita mencamkan dalam pikiran kita bahwa suatu spesimen mikroteknik dapat merupakan sebagian atau seluruhan dari struktur yang ditetapkan. Selain dilekapkan dengan kaca preparat, spesimen tadi umumnya dilindungi dengan kaca penutup, yaitu sepotong kaca yang sangat tipis ataupun plastik yang tembus pandang yang direkatkan diatas spesimen tersebut (Gunarso, 1989). Sedangkan menurut Amar (2008) Mikroteknik adalah ilmu yang akan mempelajari metode/prosedur pembuatan preparat mikroskopik.

Mikroteknik merupakan teknik pembuatan sediaan atau preparat secara  mikroskopis, tentunya pendekatan teoritis tidaklah memadai untuk memahami secara menyeluruh mengenai Mikroteknik, sebab yang namanya teknik lebih menekankan pemahaman pada wilayah aplikatifnya meskipun pada dasarnya landasan teoritis juga diperlukan dalam rangka memberikan beberapa petunjuk yang harus dilalui agar proses pembuatan sediaan sesuai dengan prosedural kerja dan alasan penggunaan ataupun pemilihan bahan yang akan digunakan dalam pembuatan sediaan Mikroskopis.

Organ adalah susunan dari bagian organisme, yang tujuannya melakukan fungsi tertentu ataupun kesatuan yang erat kaitannya. Dengan demikian pembuluh darah adalah organ yang fungsinya membawa atau mengalirkan darah. Hati adalah organ yang mempunyai banyak fungsi, akan tetapi sebagai kesatuan fungsi maka hati ini erat kaitannya dengan pencernaan dan asimilasi makanan (Gunarso, 1989).

Jaringan adalah kumpulan sel yang mempunyai fungsi tertentu yang khas bagi perkembangannya. Sebagai contoh jaringan epitelia dapat terdiri dari satu atau beberapa lapisan sel yang telah berkembang dan membantuk lapisan penutup, jenis jaringan lainnya, jaringan otot terdiri dari sel-sel yang reka membentuk otot (Gunarso, 1989).
Sel adalah bagian yang merupakan penyusun dasar suatu jaringan, dan pada kenyataannnya merupakan bagian dari semua makhluk hidup. Suatu sel dapat merupakan organisme yang lengkap, ataupun sejumlah sel dapat bergabung membentuk suatu jaringan, kombinasi penyusunnya membentuk orga-organ. Bentu-bentuk kehidupan berderajat tinggi sekalipun dimulai dari satu sel. Bila suatu organisme hanya teridiri dari satu sel, maka dinamakan Organisme Uniseluler. Sedangkan yang terbentuk oleh kumpulan sel-sel yang berbeda fungsinya dinamakan Organisme Multiseluler (Gunarso, 1989).

Metoda-metoda didalam Mikroteknik yang umum digunakan :

1.      Sediaan utuh (Whole mounts)

2.      Sediaan irisan (sectioning)

3.      Sediaan uraian (teasing)

4.      Sediaan ulasan (smearing)

Selain itu masih ada pula dikenal beberapa metoda lain seperti :

1.      Sediaan rentang (spreading preparation)

2.      Sediaan gosok – sediaan remasan (squash)

3.      Sediaan supravital

Metoda Sediaan Utuh (Whole Mounts)

Dengan metoda ini dipersiapkan sediaan yang terdiri atas keseluruhan organisme (baik hewan maupun tumhuhan) secara utuh. spesimen kultur, organ, maupun bagian organ, embrio, sel telur, spermatozoa ,potongan syaraf,pembuluh darah, jenis-jenis selaput tipis dan sebagainya. Melalui metoda ini diusahakan agar kita mendapat kesan bentuk aslinya dengan mempertahankan format-format taga dimensinya. Yang menjadi pembatas adalah faktor ukuran, ketabalan, serta tingkat transparansi sediaan yang kita buat tersebut yang berkaitan dengan faktor pembesaran pengamatan melalui mikroskop nantinya. Sediaan dengan ketebalan 2 mm dan transparan akan memungkinkan untuk diamati sampai tingkat perbasaran tidak lebih dari 30 kali. Sediaan dengan ketebalan 0,5 mm mungkin hanya akan mencapai tingkat perbesaran 100 kali. Sediaan permanen dengan ketebalan 0,2 mm atau lebih yang telah di dehidrasidan diberi media pelekap memerluka adanya suatu penunjang gelas penutup agar spesimen tidak menjadi rusak dan gelas penutupnya sendiri tidak pecah karena proses pengeringan serta pengkerutan media tersebuut. Belakangan ini umum pula digunakan tabung plastik yang dipotong-potong secara melintang hingga dihasilkan cincin-cincin penunjang dengan ketebalan yang sesuai dengan tinggi serta ketebalan speimen. Tepi tempat pemotongan sebaiknya dihaluskan dengan mengunakan kerrtas amplas (Gunarso, 1989).

Menurut (Joyner, 2008 dalam zaifbio 2010) Whole mounth merupakan metode pembuatan preparat yang nantinya akan diamati dengan mikroskop tanpa didahului adanya proses pemotongan. Jadi pada metode ini, preparat yang diamati adalah preparat yang utuh baik itu berupa sel, jaringan, organ maupun individu. Gambar yang dihasilkan oleh preparat whole mounth ini terlihat dalam wujud utuhnya seperti ketika organisme tersebut masih hidup sehingga pengamatan yang dapat dilakukan hanya terbatas terhadap morfologi secara umum saja. Metode pembuatan preparat yang digunakan untuk pengamatan secara menyeluruh, artinya mempelajari struktur vegetatif dan reproduktifnya tanpa melakukan penyayatan terhadap tanaman tersebut karena metode ini menggunakan semua bagian tanaman sebagai preparatnya. Tentu saja tanaman yang diamati haruslah berukuran kecil sehingga dapat termuat pada objek glass. Sedangkan pada tanaman yang agak besar bisa dilakukan pemangkasan agar menjadi lebih rapi dan kecil. Metode whole mounth mempunyai kelebihan dan kelemahan masing-masing. Kelebihan metode ini adalah dapat mengamati seluruh bagian tanaman dengan jelas tiap bagian-bagiannya. Sedangkan kelemahannya adalah metode ini hanya bisa dilakukan pada tanaman dengan ukuran yang kecil saja tidak bisa tanaman yang besar sehingga metode ini perlu terus dikembangkan dengan melakukan bebagai percobaan (Gunarso, 1989).
Metoda Sediaan Irisan (Sectioning)

Cara pengerjaan melalui irisan atau sayatan ini dianggap sebagai teknik rutin ataupun teknik bagi penyiapan spesimen histologi amaupun patologi. Tebal tipisnya sayatan bergantung pada pengalaman serta tujuan penyiapan spesimen. Tebal sayatan yang umum berkisar antara 6-15 mikron (1 mikron = 0,001 mm). Ukura sayatan juga sangat bervariasi, mulai dari saytaan pembuluh darah yang sangat kecil hingga sayatan otak. Ukuran sayatan biasanya terbatas pada ukuran panjang lebar 2x3 cm karena ukuran yang demikian paling sesuai untuk direkapkan pada kaca preparat yang umum digunakan. Tentu saja ukuran spesimen yang cukup kecil akan mengjasilkan sayatan juga juga jauh lebih kecil dari ukuran sayatan tersebut.

Pengirisan atau penyayatan umumnya dilakukan dengan bantuan mikrotom, walau seringkali dilakukan penyayatan dengan tangan saja untuk jenis spesimen seperti tulang, gigi ataupun benda-benda fosil seringkali diperlukan gergaji untuk memotongnya. Mikrotom adalah jenis mesin khusus dirancang dan dipasarkan untuk tujuan mikroteknik. Mesin tersebut dirancang sedemikian rupa sehingga mampu untuk melakukan penyayatan sesuatu spesimen dengan ketebalan yang sama atau paling kurang mendekati sama (Gunarso, 1989). 

Metoda Sediaan Uraian (Teasing Preparations)

Pengertian teasing adalah menguaraikan. Untuk dapat memisahkan komponen suatu jenis jaringan maupun organ tisu atau jaringan diuraikan dengan menggunakan jarum penguraian. Dengan demikian pengertian teasng ini berarti juga pembedahan dalam skala kecil. Tingkatnya pada pembedahan biasa dan pembedahan mikro yang dilakukan dengan menggunakan jarum pengurai. Teasing ini dilakukan pada jenis sediaan segar yang telah difiksasi dan mengalami pewarnaan

Secara umum jenis tisu yang bisa ditelaah melalui metode ulas ini adalah darah, limfa, cairan sum-sum tulang belakang, semen janan, sediaan air seni, serta beberapa lainnya. Masing-masing biasanya memerlukan teknik perlakuan tersendiri dalam melakukan pengulasa atau penyebaran pada kaca preparat. Untuk jenis cairan yang mengandung suspensi yang tinggi densitasnya umumnya dicairkan dengan air atau serum darah dengan perbandingan 1 : 5 atau 1 : 10 (Gunarso, 1989).

Metoda Sediaan Rentang

Pada metoda ini preparat belum difiksasi, diperlakukan sedemikian rupa sehingga disamping jelas juga mendekati keadaan aslinya dengan melalui perentangan. Jenis bahan siapan yang umum direntang saat difiksasi adalah otot, syaraf, jenis jaringan tipis (selaput yang membungkus jantung ,hate dan lain-lain) (Gunarso,1989).

Metoda Sediaan Gosok

Jenis jaringan yang keras sifatnya, seperti tulang, gigi, kuku dan beberapa lainnya mungkin sekali sangat sukar untuk dibuat sediaan sayatan (kecuali bila mengalami berbagai perlakuan khusus sebelumnya). Untuk mengatasi hal diatas tadi, maka umum juga dibuat sediaan dengan metoda gosok. Tulang misalkan tulang paha, terlebih dahulu dipotong-potong hingga ukuran beberapa mili hingga 1 – 2 cm. Potongan tersebut kemudian digosok pada batu hingga cukup tipis untuk dapat diamati pada mikroskop (Gunarso, 1989).


Metoda Sediaan Supravital

Selain jenis-jenis metoda yang dimanfaatkan materi yang mengalami matian dan fiksasi. Untuk pengamatan sel-sel darah yang masih hidup umumnya digunakan zat warna vital seperti Yanus green atau Neutral red, karena sel darah mempunyai kemampuan untuk menghisap zat warna pada konsentrasi yang sesuai. Bila kedua zat warna tersebut dipakai secara bersama-sama maka memungkinkan kita untuk mengamati mitokondria. Hanya saja akan terjadi perubahan yang sangat cepat pada sel, karena sel dapat mati oleh kedua warna tadi secara bersamaan (Gunarso, 1989).

Contoh penyiapan sediaan supervital darah adalah :

1. Satu tetes darah diteteskan pada kaca preparat

2. Teteskan pula 1 tetes zat warna (missal yanus green) dengan konsentrasi 0,25 dalam garam fisiologis3. Tutup dengan kaca penutup

4. Biarkan selama 5 menit

5. Beri lak petrolatum sekeliling tepi kaca penutup. (Lasantha, 2010)

Metoda Sediaan Remasan (Squash)

Metode remasan banyak dikakukan untuk penyaiapan pengamatan kromosom baik hewan maupun tumbuhan. Dengan metoda ini bahan diremas atau dihancurkan sehingga masing-masing sel akan terlepas yang memudahkan pengamatan selanjutnya. Jadi tujuan peremasan ini bukan berarti menghancurkan sel-selnya, tapi masing-masing sel bebas terlepas satu sama lain dengan tetap dipertahankan bentuk aslinya

Tahapan –tahapan dalam mikroteknik

1. Fiksasi (fixation)

Fiksasi bisa dengan kimiawi yaitu menggunakan senyawa formaldehide / glutardehide dan mekanik dengan cara difreezing atau boiling.Tujuan fixation adalah untuk mempertahankan bentuk sel atau jaringan seperti jaringan aslinya , serta untuk mencegah rusaknya sampel akibat autolisis atau karena bakteri dekomposisi (bakteri pengurai).

2. Dehydration dan clearing

Menggunakan alkohol yang diberikan secara bertingkat dari konsentrasi tinggi ke konsentrasi rendah. Tujuan dari dehidrasi yaitu untuk menghilangkan sisa-sisa cairan/air yang ada pada sampel sehingga saat proses selanjutnya tidak terbentuk es di dalam sampel. Setelah proses dehydration di clearing dengan larutan xyline untuk membersihkan sisa-sisa alkohol.

3. Embedding

Sampel dikeraskan dengan menggunakan lilin/waxes, resin untuk membentuk blok parapin. Dikeraskan supaya mudah untuk dilakukan pemotongan sampel.

4. Sectioning

Sampel dipotong dengan mengunakan alat pemotong misalnya microtome. Ataupun jika sebelumnya sampel difiksasi dengan cara freezing bisa selanjutnya dipotong dengan metode cryostat (pemotongan dengan dibekukan).

5. Staining

Selanjut sampel diwarnai, biasanya dengan pewarnaan hymatoksilin-eosin atau dari derivatnya yang lain yang biasa digunakan. Pewarnaan tersebut untuk mewarnai inti sel dan sitoplasmanya.

6. Mouthing

Setelah diwarnai selanjutnya sampel bisa langsung diamati dibawah mikroskop atau di proses mouthing sampel dengan tujuan untuk mempertahankan sampel jika disimpal lama, pewarnaannya dan sampelnya tidak rusak. Biasanya menggunakan canada balsem.

I.Fiksasi

Tujuan utama fiksas adalah memberikan perlakuan tertentu terhadap elemen-lemen jaringan, terutama inti sel atau nukleinya, sehingga dapat diwetkan dalam kondisis yang sedikit banyak mendekati keadaan aslinya. Selain itu, fiksasi juga mencegah terjadinya kerusakan jaringan yang disebabakan oleh mikroorganisme maupun perusakan oleh enzim yang terkandung dalam jaringan itu sendiri, yang dikenal dengan autolisis. Dengan kata lain fiksasi bertujuan:

- Mematikan (menghentikanØ proses-proses metabolisme) jaringan dengan cepat sehingga keadaannya sedikit banyak mendekati keadaan aslinya.

- Mencegah autolisis

- Menaikkan daya pewarnaan karena adanya bahan-bahan keras yang merupakan komponen cairan fiksatif.

Pada garis besarnya berdasarkan komposisi bahannya suatu fiksatif dapat dikelompok kan menjadi Fiksatif tunggal. Hanya menggunakan satu bahan kimia umum dalam bentuk larutan

Contoh: formalin ,alcohol ,asam asetat dan asam pikrat. Umumnya kurang memenuhi persyaratan sebagai fiksatif yang baik, terutama bagi tujuan mikroteknik. Masih umum digunakan untuk tujuan anatomi maupun histopatologi terutama fiksatif formalin.

Fiksatif majemuk

Umumnya berupa campuran dari beberapa fiksatif tunggal Disusun dengan formula agar dapat diperoleh sesuai keinginan dan tujuan.biasanya fiksatif campuran ini dituliskan sesuai dengan nama penemu formulanya Banyak sekali fiksatif campuran yang ada,

contoh : larutan Bouin,larutan FAA, larutan glison, dan lain sebagainya

Fiksatif berfungsi untuk menghentikan metabolisme secara cepat, mengawetkan komponen sitologis dan histologis, memperkeras tekstur yang rapuh, dan mewarnai jaringan sehingga bagian-bagiannya dapat diketahui. Faktor-faktor yang berperan dalam fiksasi adalah buffer (pH), suhu yang rendah, ketebalan irisan, perubahan volume,osmolalitas pada larutan fiksatif, konsentrasi, dan waktu fiksasi.Dehidrasi memiliki fungsi menghilangkan air dalam jaringan. Bahan yangdigunakan untuk dehidrasi harus mampu menggantikan fungsi air. Dehidrasi yang baik dilakukan secara bertahap yaitu mulai dari konsentrasi 70% sesuai dengan pelarut Bouin formol kemudian berturut-turut ke dalam alkohol 80%, 90%, 96%dan alkohol absolut. Pada setiap konsentrasi dilakukan pengulangan 3 kali.Metode paraffin merupakan cara dalam pembuatan sediaan denganmenggunakan paraffin sebagai media embedding  (penanaman).

II. Dehydration dan clearing (penjernihan)

Clearing atau dealkoholisasi ini dapat menggunakan aceton, benzol,toluol, dan xilol. Clearing dapat dilakukan selama 24 jam.Mikrotom adalah mesin untuk mengiris spesimen biologi menjadi bagianyang sangat tipis untuk pemeriksaan mikroskop. Beberapa mikrotommenggunakan pisau baja dan digunakan untuk mempersiapkan sayatan jaringan hewan atau tumbuhan dalam histologi (Wikipedia). Jenis-jenis mikrotom yang bisa dipakai pada mikroteknik adalah:1. Rocking microtom, cara kerjanya seperti mengatam kayu, biasanya untuk organ-organ keras seperti kayu2. Rotary microtom atau mikrotom putar, cara kerjanya dengan di putar yang akanmengerakan objek maju dan naik turun, sementara pisaunya tetap. Mikrotom ini biasanya dipakai dalam mikroteknik metode paraffin3. Sliding microtom atau mikrotom sorong, dimana jaringan tetap posisinya dan pisau yang bergerak maju dan mundur. Mikrotom ini sering digunakan padamikroteknik metode paraffin, walau umumnya digunakan pada penyayayan jaringan yang di tanam dalam celloidin. Biasanya digunakan pada objek-objek yang keras.4. Freezing microtom atau mikrotom beku, sering digunakan untuk penyayatan jaringan yang tidak ditanam dalam paraffin maupun dalam celloidin, jadi jaringanyang disayat adalah jaringan yang tidak di tanam tetapi dibekukan denganmemakai gas CO2. Keuntungan dari mikrotom ini adalah waktu yang dipakailebih pendek, karena langsung disayat setelah proses fiksasi. Kerugiannya adalah bila temperature kamar tinggi, objek menjadi lunak sehingga sulit dipotong. Hal-hal yang harus diperhatikan dalam proses penyayatan ini adalah:o Mikrotom harus seberat mungkino Meja tempat mikrotom harus stabilo Pisau harus cocok dengan mikrotomo Posisi pisau harus stabilo Mata bisau harus tajam, bersih dan suhunya harus sama dengan balok jaringanyang akan disayat.