MIKROTEKNIK
Mikroteknik merupakan ilmu atau seni mempersiapkan organ, jaringan atau bagian jaringan untuk dapat diamati dan ditelaah. Penelaahan umumnya dilakukan dengan bantuan mikroskop, karena struktur jaringan secara terperinci pada galibnya terlalu kecil untuk dapat dilihat dengan mata telanjang. Ruang lingkup yang mencakup materi mikroteknik dapat diperoleh dari sejumlah definisi dan peristilahan yang bisa dipakai, hanya saja sebaiknya kita mencamkan dalam pikiran kita bahwa suatu spesimen mikroteknik dapat merupakan sebagian atau seluruhan dari struktur yang ditetapkan. Selain dilekapkan dengan kaca preparat, spesimen tadi umumnya dilindungi dengan kaca penutup, yaitu sepotong kaca yang sangat tipis ataupun plastik yang tembus pandang yang direkatkan diatas spesimen tersebut (Gunarso, 1989). Sedangkan menurut Amar (2008) Mikroteknik adalah ilmu yang akan mempelajari metode/prosedur pembuatan preparat mikroskopik.
Mikroteknik merupakan teknik pembuatan sediaan atau preparat secara mikroskopis, tentunya pendekatan teoritis tidaklah memadai untuk memahami secara menyeluruh mengenai Mikroteknik, sebab yang namanya teknik lebih menekankan pemahaman pada wilayah aplikatifnya meskipun pada dasarnya landasan teoritis juga diperlukan dalam rangka memberikan beberapa petunjuk yang harus dilalui agar proses pembuatan sediaan sesuai dengan prosedural kerja dan alasan penggunaan ataupun pemilihan bahan yang akan digunakan dalam pembuatan sediaan Mikroskopis.
Organ adalah susunan dari bagian organisme, yang tujuannya melakukan fungsi tertentu ataupun kesatuan yang erat kaitannya. Dengan demikian pembuluh darah adalah organ yang fungsinya membawa atau mengalirkan darah. Hati adalah organ yang mempunyai banyak fungsi, akan tetapi sebagai kesatuan fungsi maka hati ini erat kaitannya dengan pencernaan dan asimilasi makanan (Gunarso, 1989).
Jaringan adalah kumpulan sel yang mempunyai fungsi tertentu yang khas bagi perkembangannya. Sebagai contoh jaringan epitelia dapat terdiri dari satu atau beberapa lapisan sel yang telah berkembang dan membantuk lapisan penutup, jenis jaringan lainnya, jaringan otot terdiri dari sel-sel yang reka membentuk otot (Gunarso, 1989).
Sel adalah bagian yang merupakan penyusun dasar suatu jaringan, dan pada kenyataannnya merupakan bagian dari semua makhluk hidup. Suatu sel dapat merupakan organisme yang lengkap, ataupun sejumlah sel dapat bergabung membentuk suatu jaringan, kombinasi penyusunnya membentuk orga-organ. Bentu-bentuk kehidupan berderajat tinggi sekalipun dimulai dari satu sel. Bila suatu organisme hanya teridiri dari satu sel, maka dinamakan Organisme Uniseluler. Sedangkan yang terbentuk oleh kumpulan sel-sel yang berbeda fungsinya dinamakan Organisme Multiseluler (Gunarso, 1989).
Sel adalah bagian yang merupakan penyusun dasar suatu jaringan, dan pada kenyataannnya merupakan bagian dari semua makhluk hidup. Suatu sel dapat merupakan organisme yang lengkap, ataupun sejumlah sel dapat bergabung membentuk suatu jaringan, kombinasi penyusunnya membentuk orga-organ. Bentu-bentuk kehidupan berderajat tinggi sekalipun dimulai dari satu sel. Bila suatu organisme hanya teridiri dari satu sel, maka dinamakan Organisme Uniseluler. Sedangkan yang terbentuk oleh kumpulan sel-sel yang berbeda fungsinya dinamakan Organisme Multiseluler (Gunarso, 1989).
Metoda-metoda didalam Mikroteknik yang umum digunakan :
1. Sediaan utuh (Whole mounts)
2. Sediaan irisan (sectioning)
3. Sediaan uraian (teasing)
4. Sediaan ulasan (smearing)
Selain itu masih ada pula dikenal beberapa metoda lain seperti :
1. Sediaan rentang (spreading preparation)
2. Sediaan gosok – sediaan remasan (squash)
3. Sediaan supravital
Metoda Sediaan Utuh (Whole Mounts)
Dengan metoda ini dipersiapkan sediaan yang terdiri atas keseluruhan organisme (baik hewan maupun tumhuhan) secara utuh. spesimen kultur, organ, maupun bagian organ, embrio, sel telur, spermatozoa ,potongan syaraf,pembuluh darah, jenis-jenis selaput tipis dan sebagainya. Melalui metoda ini diusahakan agar kita mendapat kesan bentuk aslinya dengan mempertahankan format-format taga dimensinya. Yang menjadi pembatas adalah faktor ukuran, ketabalan, serta tingkat transparansi sediaan yang kita buat tersebut yang berkaitan dengan faktor pembesaran pengamatan melalui mikroskop nantinya. Sediaan dengan ketebalan 2 mm dan transparan akan memungkinkan untuk diamati sampai tingkat perbasaran tidak lebih dari 30 kali. Sediaan dengan ketebalan 0,5 mm mungkin hanya akan mencapai tingkat perbesaran 100 kali. Sediaan permanen dengan ketebalan 0,2 mm atau lebih yang telah di dehidrasidan diberi media pelekap memerluka adanya suatu penunjang gelas penutup agar spesimen tidak menjadi rusak dan gelas penutupnya sendiri tidak pecah karena proses pengeringan serta pengkerutan media tersebuut. Belakangan ini umum pula digunakan tabung plastik yang dipotong-potong secara melintang hingga dihasilkan cincin-cincin penunjang dengan ketebalan yang sesuai dengan tinggi serta ketebalan speimen. Tepi tempat pemotongan sebaiknya dihaluskan dengan mengunakan kerrtas amplas (Gunarso, 1989).
Menurut (Joyner, 2008 dalam zaifbio 2010) Whole mounth merupakan metode pembuatan preparat yang nantinya akan diamati dengan mikroskop tanpa didahului adanya proses pemotongan. Jadi pada metode ini, preparat yang diamati adalah preparat yang utuh baik itu berupa sel, jaringan, organ maupun individu. Gambar yang dihasilkan oleh preparat whole mounth ini terlihat dalam wujud utuhnya seperti ketika organisme tersebut masih hidup sehingga pengamatan yang dapat dilakukan hanya terbatas terhadap morfologi secara umum saja. Metode pembuatan preparat yang digunakan untuk pengamatan secara menyeluruh, artinya mempelajari struktur vegetatif dan reproduktifnya tanpa melakukan penyayatan terhadap tanaman tersebut karena metode ini menggunakan semua bagian tanaman sebagai preparatnya. Tentu saja tanaman yang diamati haruslah berukuran kecil sehingga dapat termuat pada objek glass. Sedangkan pada tanaman yang agak besar bisa dilakukan pemangkasan agar menjadi lebih rapi dan kecil. Metode whole mounth mempunyai kelebihan dan kelemahan masing-masing. Kelebihan metode ini adalah dapat mengamati seluruh bagian tanaman dengan jelas tiap bagian-bagiannya. Sedangkan kelemahannya adalah metode ini hanya bisa dilakukan pada tanaman dengan ukuran yang kecil saja tidak bisa tanaman yang besar sehingga metode ini perlu terus dikembangkan dengan melakukan bebagai percobaan (Gunarso, 1989).
Metoda Sediaan Irisan (Sectioning)
Metoda Sediaan Irisan (Sectioning)
Cara pengerjaan melalui irisan atau sayatan ini dianggap sebagai teknik rutin ataupun teknik bagi penyiapan spesimen histologi amaupun patologi. Tebal tipisnya sayatan bergantung pada pengalaman serta tujuan penyiapan spesimen. Tebal sayatan yang umum berkisar antara 6-15 mikron (1 mikron = 0,001 mm). Ukura sayatan juga sangat bervariasi, mulai dari saytaan pembuluh darah yang sangat kecil hingga sayatan otak. Ukuran sayatan biasanya terbatas pada ukuran panjang lebar 2x3 cm karena ukuran yang demikian paling sesuai untuk direkapkan pada kaca preparat yang umum digunakan. Tentu saja ukuran spesimen yang cukup kecil akan mengjasilkan sayatan juga juga jauh lebih kecil dari ukuran sayatan tersebut.
Pengirisan atau penyayatan umumnya dilakukan dengan bantuan mikrotom, walau seringkali dilakukan penyayatan dengan tangan saja untuk jenis spesimen seperti tulang, gigi ataupun benda-benda fosil seringkali diperlukan gergaji untuk memotongnya. Mikrotom adalah jenis mesin khusus dirancang dan dipasarkan untuk tujuan mikroteknik. Mesin tersebut dirancang sedemikian rupa sehingga mampu untuk melakukan penyayatan sesuatu spesimen dengan ketebalan yang sama atau paling kurang mendekati sama (Gunarso, 1989).
Metoda Sediaan Uraian (Teasing Preparations)
Pengertian teasing adalah menguaraikan. Untuk dapat memisahkan komponen suatu jenis jaringan maupun organ tisu atau jaringan diuraikan dengan menggunakan jarum penguraian. Dengan demikian pengertian teasng ini berarti juga pembedahan dalam skala kecil. Tingkatnya pada pembedahan biasa dan pembedahan mikro yang dilakukan dengan menggunakan jarum pengurai. Teasing ini dilakukan pada jenis sediaan segar yang telah difiksasi dan mengalami pewarnaan
Secara umum jenis tisu yang bisa ditelaah melalui metode ulas ini adalah darah, limfa, cairan sum-sum tulang belakang, semen janan, sediaan air seni, serta beberapa lainnya. Masing-masing biasanya memerlukan teknik perlakuan tersendiri dalam melakukan pengulasa atau penyebaran pada kaca preparat. Untuk jenis cairan yang mengandung suspensi yang tinggi densitasnya umumnya dicairkan dengan air atau serum darah dengan perbandingan 1 : 5 atau 1 : 10 (Gunarso, 1989).
Metoda Sediaan Rentang
Pada metoda ini preparat belum difiksasi, diperlakukan sedemikian rupa sehingga disamping jelas juga mendekati keadaan aslinya dengan melalui perentangan. Jenis bahan siapan yang umum direntang saat difiksasi adalah otot, syaraf, jenis jaringan tipis (selaput yang membungkus jantung ,hate dan lain-lain) (Gunarso,1989).
Metoda Sediaan Gosok
Jenis jaringan yang keras sifatnya, seperti tulang, gigi, kuku dan beberapa lainnya mungkin sekali sangat sukar untuk dibuat sediaan sayatan (kecuali bila mengalami berbagai perlakuan khusus sebelumnya). Untuk mengatasi hal diatas tadi, maka umum juga dibuat sediaan dengan metoda gosok. Tulang misalkan tulang paha, terlebih dahulu dipotong-potong hingga ukuran beberapa mili hingga 1 – 2 cm. Potongan tersebut kemudian digosok pada batu hingga cukup tipis untuk dapat diamati pada mikroskop (Gunarso, 1989).
Metoda Sediaan Supravital
Selain jenis-jenis metoda yang dimanfaatkan materi yang mengalami matian dan fiksasi. Untuk pengamatan sel-sel darah yang masih hidup umumnya digunakan zat warna vital seperti Yanus green atau Neutral red, karena sel darah mempunyai kemampuan untuk menghisap zat warna pada konsentrasi yang sesuai. Bila kedua zat warna tersebut dipakai secara bersama-sama maka memungkinkan kita untuk mengamati mitokondria. Hanya saja akan terjadi perubahan yang sangat cepat pada sel, karena sel dapat mati oleh kedua warna tadi secara bersamaan (Gunarso, 1989).Metoda Sediaan Supravital
Contoh penyiapan sediaan supervital darah adalah :
1. Satu tetes darah diteteskan pada kaca preparat
2. Teteskan pula 1 tetes zat warna (missal yanus green) dengan konsentrasi 0,25 dalam garam fisiologis3. Tutup dengan kaca penutup
4. Biarkan selama 5 menit
5. Beri lak petrolatum sekeliling tepi kaca penutup. (Lasantha, 2010)
Metoda Sediaan Remasan (Squash)
Metode remasan banyak dikakukan untuk penyaiapan pengamatan kromosom baik hewan maupun tumbuhan. Dengan metoda ini bahan diremas atau dihancurkan sehingga masing-masing sel akan terlepas yang memudahkan pengamatan selanjutnya. Jadi tujuan peremasan ini bukan berarti menghancurkan sel-selnya, tapi masing-masing sel bebas terlepas satu sama lain dengan tetap dipertahankan bentuk aslinya
Tahapan –tahapan dalam mikroteknik
1. Fiksasi (fixation)
Fiksasi bisa dengan kimiawi yaitu menggunakan senyawa formaldehide / glutardehide dan mekanik dengan cara difreezing atau boiling.Tujuan fixation adalah untuk mempertahankan bentuk sel atau jaringan seperti jaringan aslinya , serta untuk mencegah rusaknya sampel akibat autolisis atau karena bakteri dekomposisi (bakteri pengurai).
2. Dehydration dan clearing
Menggunakan alkohol yang diberikan secara bertingkat dari konsentrasi tinggi ke konsentrasi rendah. Tujuan dari dehidrasi yaitu untuk menghilangkan sisa-sisa cairan/air yang ada pada sampel sehingga saat proses selanjutnya tidak terbentuk es di dalam sampel. Setelah proses dehydration di clearing dengan larutan xyline untuk membersihkan sisa-sisa alkohol.
3. Embedding
Sampel dikeraskan dengan menggunakan lilin/waxes, resin untuk membentuk blok parapin. Dikeraskan supaya mudah untuk dilakukan pemotongan sampel.
4. Sectioning
Sampel dipotong dengan mengunakan alat pemotong misalnya microtome. Ataupun jika sebelumnya sampel difiksasi dengan cara freezing bisa selanjutnya dipotong dengan metode cryostat (pemotongan dengan dibekukan).
5. Staining
Selanjut sampel diwarnai, biasanya dengan pewarnaan hymatoksilin-eosin atau dari derivatnya yang lain yang biasa digunakan. Pewarnaan tersebut untuk mewarnai inti sel dan sitoplasmanya.
6. Mouthing
Setelah diwarnai selanjutnya sampel bisa langsung diamati dibawah mikroskop atau di proses mouthing sampel dengan tujuan untuk mempertahankan sampel jika disimpal lama, pewarnaannya dan sampelnya tidak rusak. Biasanya menggunakan canada balsem.
I.Fiksasi
Tujuan utama fiksas adalah memberikan perlakuan tertentu terhadap elemen-lemen jaringan, terutama inti sel atau nukleinya, sehingga dapat diwetkan dalam kondisis yang sedikit banyak mendekati keadaan aslinya. Selain itu, fiksasi juga mencegah terjadinya kerusakan jaringan yang disebabakan oleh mikroorganisme maupun perusakan oleh enzim yang terkandung dalam jaringan itu sendiri, yang dikenal dengan autolisis. Dengan kata lain fiksasi bertujuan:
- Mematikan (menghentikanØ proses-proses metabolisme) jaringan dengan cepat sehingga keadaannya sedikit banyak mendekati keadaan aslinya.
- Mencegah autolisis
- Menaikkan daya pewarnaan karena adanya bahan-bahan keras yang merupakan komponen cairan fiksatif.
Pada garis besarnya berdasarkan komposisi bahannya suatu fiksatif dapat dikelompok kan menjadi Fiksatif tunggal. Hanya menggunakan satu bahan kimia umum dalam bentuk larutan
Contoh: formalin ,alcohol ,asam asetat dan asam pikrat. Umumnya kurang memenuhi persyaratan sebagai fiksatif yang baik, terutama bagi tujuan mikroteknik. Masih umum digunakan untuk tujuan anatomi maupun histopatologi terutama fiksatif formalin.
Fiksatif majemuk
Umumnya berupa campuran dari beberapa fiksatif tunggal Disusun dengan formula agar dapat diperoleh sesuai keinginan dan tujuan.biasanya fiksatif campuran ini dituliskan sesuai dengan nama penemu formulanya Banyak sekali fiksatif campuran yang ada,
contoh : larutan Bouin,larutan FAA, larutan glison, dan lain sebagainya
Fiksatif berfungsi untuk menghentikan metabolisme secara cepat, mengawetkan komponen sitologis dan histologis, memperkeras tekstur yang rapuh, dan mewarnai jaringan sehingga bagian-bagiannya dapat diketahui. Faktor-faktor yang berperan dalam fiksasi adalah buffer (pH), suhu yang rendah, ketebalan irisan, perubahan volume,osmolalitas pada larutan fiksatif, konsentrasi, dan waktu fiksasi.Dehidrasi memiliki fungsi menghilangkan air dalam jaringan. Bahan yangdigunakan untuk dehidrasi harus mampu menggantikan fungsi air. Dehidrasi yang baik dilakukan secara bertahap yaitu mulai dari konsentrasi 70% sesuai dengan pelarut Bouin formol kemudian berturut-turut ke dalam alkohol 80%, 90%, 96%dan alkohol absolut. Pada setiap konsentrasi dilakukan pengulangan 3 kali.Metode paraffin merupakan cara dalam pembuatan sediaan denganmenggunakan paraffin sebagai media embedding (penanaman).
II. Dehydration dan clearing (penjernihan)
Clearing atau dealkoholisasi ini dapat menggunakan aceton, benzol,toluol, dan xilol. Clearing dapat dilakukan selama 24 jam.Mikrotom adalah mesin untuk mengiris spesimen biologi menjadi bagianyang sangat tipis untuk pemeriksaan mikroskop. Beberapa mikrotommenggunakan pisau baja dan digunakan untuk mempersiapkan sayatan jaringan hewan atau tumbuhan dalam histologi (Wikipedia). Jenis-jenis mikrotom yang bisa dipakai pada mikroteknik adalah:1. Rocking microtom, cara kerjanya seperti mengatam kayu, biasanya untuk organ-organ keras seperti kayu2. Rotary microtom atau mikrotom putar, cara kerjanya dengan di putar yang akanmengerakan objek maju dan naik turun, sementara pisaunya tetap. Mikrotom ini biasanya dipakai dalam mikroteknik metode paraffin3. Sliding microtom atau mikrotom sorong, dimana jaringan tetap posisinya dan pisau yang bergerak maju dan mundur. Mikrotom ini sering digunakan padamikroteknik metode paraffin, walau umumnya digunakan pada penyayayan jaringan yang di tanam dalam celloidin. Biasanya digunakan pada objek-objek yang keras.4. Freezing microtom atau mikrotom beku, sering digunakan untuk penyayatan jaringan yang tidak ditanam dalam paraffin maupun dalam celloidin, jadi jaringanyang disayat adalah jaringan yang tidak di tanam tetapi dibekukan denganmemakai gas CO2. Keuntungan dari mikrotom ini adalah waktu yang dipakailebih pendek, karena langsung disayat setelah proses fiksasi. Kerugiannya adalah bila temperature kamar tinggi, objek menjadi lunak sehingga sulit dipotong. Hal-hal yang harus diperhatikan dalam proses penyayatan ini adalah:o Mikrotom harus seberat mungkino Meja tempat mikrotom harus stabilo Pisau harus cocok dengan mikrotomo Posisi pisau harus stabilo Mata bisau harus tajam, bersih dan suhunya harus sama dengan balok jaringanyang akan disayat.
Tahap-tahap Di Dalam Clearing/Dealkoholisasi/Penjernihan :
Alkohol Xylol 3 : 1
Alkohol Xylol 1 : 1
Alkohol xylol 1 : 3
Xylol 2 (p.a)
Ini memudahkan dalam membuat irisan yang sangat tipis (10 mikrometer) dengan menggunakan mikrotom. Agar paraffin dapat masuk ke dalam sel, alkohol didalam organ harus diganti dengan zat yang mudah mengusir alkohol sebelum bisa diusir oleh paraffin. Clearing atau dealkoholisasi ini dapat menggunakan aceton, benzol,toluol, dan xilol. Clearing dapat dilakukan selama 24 jam .Mikrotom adalah mesin untuk mengiris spesimen biologi menjadi bagianyang sangat tipis untuk pemeriksaan mikroskop. Beberapa mikrotom menggunakan pisau baja dan digunakan untuk mempersiapkan sayatan jaringan hewan atau tumbuhan dalam histology (Wikipedia).
Jenis-jenis mikrotom yang bisa dipakai pada mikroteknik adalah:
Jenis-jenis mikrotom yang bisa dipakai pada mikroteknik adalah:
1. Rocking microtom, cara kerjanya seperti mengatam kayu, biasanya untuk organ-organ keras seperti kayu
2. Rotary microtom atau mikrotom putar, cara kerjanya dengan di putar yang akanmengerakan objek maju dan naik turun, sementara pisaunya tetap. Mikrotom ini biasanya dipakai dalam mikroteknik metode paraffin
3. Sliding microtom atau mikrotom sorong, dimana jaringan tetap posisinya dan pisau yang bergerak maju dan mundur. Mikrotom ini sering digunakan padamikroteknik metode paraffin, walau umumnya digunakan pada penyayayan jaringan yang di tanam dalam celloidin. Biasanya digunakan pada objek-objek yang keras.
4. Freezing microtom atau mikrotom beku, sering digunakan untuk penyayatan jaringan yang tidak ditanam dalam paraffin maupun dalam celloidin, jadi jaringanyang disayat adalah jaringan yang tidak di tanam tetapi dibekukan denganmemakai gas CO2. Keuntungan dari mikrotom ini adalah waktu yang dipakailebih pendek, karena langsung disayat setelah proses fiksasi. Kerugiannya adalah bila temperature kamar tinggi, objek menjadi lunak sehingga sulit dipotong.Hal-hal yang harus diperhatikan dalam proses penyayatan ini adalah:
- Mikrotom harus seberat mungkin
- Meja tempat mikrotom harus stabil
- Pisau harus cocok dengan mikrotomo
- Posisi pisau harus stabilo
- Mata bisau harus tajam, bersih dan suhunya harus sama dengan balok jaringan yang akan disayat.
II. Sectioning (Pemotongan)
Sebelum pemotongan oleh microtomy, materi biologi biasanya ditempatkan dalam fiksatif lebih kaku, dalam sebuah proses yang dikenal sebagai embedding. Hal ini dicapai dengan masuknya zat cair di sekitar sampel, seperti parafin (lilin) atau epoxy, yang ditempatkan dalam cetakan dan kemudian mengeras untuk menghasilkan sebuah "blok" yang mudah dipotong.
Proses penyayatan mencakup berbagai cara akan menghasilkan sayatan tipis tisu baik yang telah mengalami proses penanaman maupun tidak. Dalam mikroteknik, cara lazim digunakan adalah penyayatan dengan menggunakan mikrotom dengan berbagai peralatan pembantu seperti pisau mikrotom, kuas bulu, spatula, gunting serta pensil penoreh..
Mikrotom.Alat khusus yang diracang untuk menyayat material atau tisu-tisu dengan sayatan-sayatan yang cukup tipis untuk penelaahan dengan mikroskop.
Untuk memperoleh hasil sayatan yang baik dibutuhkan beberapa persayaratan sebagai berikut :
Sebelum pemotongan oleh microtomy, materi biologi biasanya ditempatkan dalam fiksatif lebih kaku, dalam sebuah proses yang dikenal sebagai embedding. Hal ini dicapai dengan masuknya zat cair di sekitar sampel, seperti parafin (lilin) atau epoxy, yang ditempatkan dalam cetakan dan kemudian mengeras untuk menghasilkan sebuah "blok" yang mudah dipotong.
Proses penyayatan mencakup berbagai cara akan menghasilkan sayatan tipis tisu baik yang telah mengalami proses penanaman maupun tidak. Dalam mikroteknik, cara lazim digunakan adalah penyayatan dengan menggunakan mikrotom dengan berbagai peralatan pembantu seperti pisau mikrotom, kuas bulu, spatula, gunting serta pensil penoreh..
Mikrotom.Alat khusus yang diracang untuk menyayat material atau tisu-tisu dengan sayatan-sayatan yang cukup tipis untuk penelaahan dengan mikroskop.
Untuk memperoleh hasil sayatan yang baik dibutuhkan beberapa persayaratan sebagai berikut :
1. Tisu yang telah dipersiapkan dengan sempurna
2. Pisau yang cukup tajam
3. Pemilihan jenis mikrotom yang tepat
4. Operator yang cukup terampil dan terlatih
Deklinasi adalah sudut kontak antara sampel dan vertikal pisau. Jika pisau berada pada sudut kanan (deklinasi = 90) memotong dibuat langsung menggunakan mode tekanan berbasis, dan kekuatan karena itu secara proporsional lebih besar. Namun jika pisau dimiringkan, gerakan relatif dari pisau semakin sejajar dengan gerak sampel, memungkinkan untuk tindakan mengiris. Perilaku ini sangat penting untuk sampel besar atau keras
Kemiringan pisau adalah sudut antara wajah pisau dan sampel. Untuk hasil yang optimal, sudut ini harus dipilih secara tepat. Sudut yang optimal tergantung pada geometri pisau, kecepatan potong dan parameter lainnya. Jika sudut disesuaikan dengan nol, pisau potong sering dapat menjadi tidak menentu, dan lokasi baru dari pisau harus digunakan untuk kelancaran keluar ini. Jika sudut terlalu besar, sampel mampu menggumpalkan dan pisau dapat menyebabkan variasi ketebalan periodik dalam memotong.
Deklinasi adalah sudut kontak antara sampel dan vertikal pisau. Jika pisau berada pada sudut kanan (deklinasi = 90) memotong dibuat langsung menggunakan mode tekanan berbasis, dan kekuatan karena itu secara proporsional lebih besar. Namun jika pisau dimiringkan, gerakan relatif dari pisau semakin sejajar dengan gerak sampel, memungkinkan untuk tindakan mengiris. Perilaku ini sangat penting untuk sampel besar atau keras
Kemiringan pisau adalah sudut antara wajah pisau dan sampel. Untuk hasil yang optimal, sudut ini harus dipilih secara tepat. Sudut yang optimal tergantung pada geometri pisau, kecepatan potong dan parameter lainnya. Jika sudut disesuaikan dengan nol, pisau potong sering dapat menjadi tidak menentu, dan lokasi baru dari pisau harus digunakan untuk kelancaran keluar ini. Jika sudut terlalu besar, sampel mampu menggumpalkan dan pisau dapat menyebabkan variasi ketebalan periodik dalam memotong.
III. Afixing (Afiksasi)
Afiksasi atau proses perlekatan adalah proses perlekatan atau penetapan sayatan tisu yang pada kaca preparat dengan bantuan media prekat tertentu. Pada proses ini diperlukan berbagai persiapan antara lain :
a. Kaca preparat bersih
b. Media prekat
c. Akuades
d. Meja pemanas/hot plate
e. Peralata berupa pinset, skapel, gunting, kuas dan lain sebagainya.
Dari beberapa jenis formula media prekat yang umum digunakan dalam kerja rutin adalah media merekat albumin. Mula-mula putih telur dan gliserin dikock hingga rata, busa yang terjadi dibuang dan bila perlu dilakukan penyaringan, kemudian dibubuhkan kristal-kristal thymol yang berfungsi sebagai pencegah berkembangnya jamur dan bakteri serta beberapa tetes akuades sebagai pengencer.
VI. Deparafinisasi
Deparafinisasi adalah proses penghilangan parafin menggunakan xylol.
Adapun langkah-langkah deparafinisasi adalah :
Adapun langkah-langkah deparafinisasi adalah :
Jaringan dimasukkan kedalam xylol (xylol 1 dan xylol 2) masing-masing selama 30 menit Redehidrasi dengan alkohol dari tinggi ke rendah (100%, 96%, 80%, 70%, 50% dan 30%) kemudian cuci dengan air mengalir setelah itu celupkan ke dalam akuades.
IV. Staining / Pewarnaan
Pewarnaan merupakan suatu tahap dalam mikroteknik untuk mempertajamatau memperjelas berbagai elemen jaringan, terutama sel-seknya, sehingga dapatdibedakan dan ditelaah dengan mikroskop.tanpa pewarnaan, jaringan akantransparan sehingga sulit untuk diamati.Pewarnaan akan memperjelas rinci suatu jaringan sehinnga mudah untuk dipelajari. Pewarnaan dibedakan antara non vital dengan vitala. Pewarnaan non vital, pewarnaan dilakukan setelah jaringan dimatikan melaluifiksasi. Teknik ini merupakan teknik dan cara yang paling alzim digunakan,terutama untuk pekerjaan rutin sehari-hari, terutama pembuatan preparat/sediaan praktikum bagi mahasiswa. b. Pewarnaan vital, maka proses pewarnaan dilakukan selagi jaringan/sel masihdalam keadaan hidup. Sel-sel yang masih hidup tersebut diharapkan mampu untuk menyerap warna maupun mengikat/memfagosit partikel-partikel zat warna.Dengan demikian zat warna yang hendaknya yang tidak bersifat toksik bagi sel-sel tersebut. Sebagai contoh, tinta china dan lithium carmine secara umumdigunakan untuk mengamati penyebaran sifat sel-sel RES, karena sel-sel tersebutmampu memfagosit zat warna.c. Pewarnaan supra-vital diharapkan pada hasil kultur sel dan jaringanDalam arti yang sangat luas, zat warna mencakup bahan organic dan bahananorganik, yang mengadakan ikatan dengan jaringan lebih jelas untuk diamati.Ditinjau dari berbagai segi, maka zat warna dapat kita bedakan atau kelompokan pada kategori-kategori tertentu.
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Jimmo, 2008).
Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah ”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja (Gupte, 1990). Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994).
Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel microbe atau bagian-bagian sel microbe disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan pengecatan kapsul.(waluyo,2010)
Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme. Zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan strukur seperti spora, flagela, dan bahan inklusi yng mengandung zat pati dan granula fosfat (Entjang, 2003)
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi.
Tujuan dari pewarnaan terhadap mikroorganisme yaitu:
1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, maupun fungi.
2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad
3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan struktur dalam jasad.
4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik dan kimia dapat diketahui.
Langkah-langkah utama teknik pewarnaan
1. Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis
2. Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan kimia seperti sabun, formalin, fenol.
3. Aplikasi zat warna : tunggal, atau lebih dari 1 zat warna
Teknik pewarnaan dikelompokkan menjadi beberapa tipe, berdasarkan respon sel bakteri terhadap zat pewarna dan sistem pewarnaan yang digunakan untuk pemisahan kelompok bakteri digunakan pewarnaan Gram, dan pewarnaan “acid-fast”(tahan asam) untuk genusMycobacterium.
Untuk melihat struktur digunakan pewarnaan flagela, pewarnaan kapsul, pewarnaan spora, dan pewarnaan nukleus. Pewarnaan Neisser atau Albert digunakan untuk melihat granula metakromatik (volutin bodies) pada Corynebacterium diphtheriae. Untuk semua prosedur pewarnaan mikrobiologi dibutuhkan pembuatan apusan lebih dahulu sebelum melaksanakan beberapa teknik pewarnaan yang spesifik (Pelezar,2008).
Macam-Macam Pewarnaan
Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut :
I. Pewarnaan sederhana
Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin) tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif).
Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut. Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak digunakan adalah biru metilen (30-60 detik), ungu kristal (10 detik) dan fukhsin-karbol (5 detik)
II. Pewarnaan differensial dibagi menjadi pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam
Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam. Penjelasan sebagai berikut:
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.
Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram.
Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :
Zat warna utama (violet kristal)
Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama.
Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.
Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.
Langkah-langkah untuk pewarnaan gram adalah sebagai berikut:
Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut. Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak digunakan adalah biru metilen (30-60 detik), ungu kristal (10 detik) dan fukhsin-karbol (5 detik)
II. Pewarnaan differensial dibagi menjadi pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam
Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam. Penjelasan sebagai berikut:
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.
Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram.
Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :
Zat warna utama (violet kristal)
Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama.
Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.
Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.
Langkah-langkah untuk pewarnaan gram adalah sebagai berikut:
- Penambahan Kristal violet
- Penambahan Iodin
- Pencucian dengan Alkohol
- Penambahan Safranin
Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).
Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif yaitu:
Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:
Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam
Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:
Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
Pewarnaan Tahan Asam
Teknik pewarnaan ini dapat digunakan untuk mendiagnosa keberadaan bakteri penyebab tuberkulosis
yaitu Mycobacterium tuberculosis . Ada beberapa cara pewarnaan tahan asam, namun yang paling
banyak adalah cara menurut Ziehl-Neelsen.(anonymous,2009)
Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaituPerbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).
Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif yaitu:
Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:
Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam
lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak mengandung asam
tekoat
Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat
Peka terhadap streptomisin
Toksin yang dibentuk EndotoksinCiri-ciri bakteri gram positif yaitu:
tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.
Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
Pewarnaan Tahan Asam
Pewarnaan ini ditujukan terhadap bakteri yang mengandung lemak dalam konsentrasi tinggi sehingga sukar
menyerap zat warna, namun jika bakteri diberi zat warna khusus misalnya karbolfukhsin melalui proses
pemanasan, maka akan menyerap zat warna dan akan tahan diikat tanpa mampu dilunturkan oleh peluntur
yang kuat sekalipun seperti asam-alkohol. Karena itu bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA).Teknik pewarnaan ini dapat digunakan untuk mendiagnosa keberadaan bakteri penyebab tuberkulosis
yaitu Mycobacterium tuberculosis . Ada beberapa cara pewarnaan tahan asam, namun yang paling
banyak adalah cara menurut Ziehl-Neelsen.(anonymous,2009)
III. Pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu : pewarnaan flagel, pewarnaan spora, pewarnaan kapsul.
Pewarnaan Spora
Spora bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa, diperlukan teknik pewarnaan khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora yang paling banyak digunakan.
Endospora sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk pewarnaan endspores, perlu dilakukan pemanasan supaya cat malachite hijau bisa masuk ke dalam spora , seperti halnya pada pewarnaan Basil Tahan Asam dimana cat carbol fuschsin harus dipanaskan untuk bisa menembus lapisan lilin asam mycolic dari Mycobacterium .
Prinsip kerja:
Spora kuman mempunyai dinding yang tebal sehingga diperlukan pemanasan agar pori-pori membesar zat warna fuchsin dapat masuk, dengan pencucian pori-pori kembali mengecil menyebabkan zat warna fuchsin tidak dapat dilepas walaupun dilunturkan dengan asam alkohol, sedangkan pada badan bakteri warna fuchsin dilepaskan dan mengambil warna biru dari methylen blue
Cara Kerja :
a) Dibuat suspensi kuman, ditambah dengan carbol fuchsin sama banyak.
b) Dipanaskan selama 6 menit pada api kecil atau pada penangas air 80oc selama 10 menit.
c) Dibuat sediaan dan dikeringkan.
d) Dimasukkan kedalam H2SO4 1% selama 2 detik
e) Dimasukkan kedalam alkohol sehingga tidak ada lagi warna merah mengalir.
f) Sediaan dicuci dengan air.
g) Diwarnai dengan methylen blue selama 1 menit kemudian dicuci dan dikeringkan.
h) Diperiksa dibawah mikroskop.
Pewarnaan flagel
Pewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.
Pewarnaan kapsul
Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang. Yang berwana biru gelap.
IV. Pewarnaan khusus untuk melihat komponen lain dan bakteri :
a) pewarnaan Neisser (granula volutin),
b) pewarnaan yodium (granula glikogen).
c)
V. Pewarnaan negatif
Mempelajari penggunaan prosedur pewarnaan negatif untuk mengamati morfologi organisme yang sukar diwarnai oleh pewarna sederhana. Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang. Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaeta
Cara pewarnaan negatif
- Sediaan hapus → teteskan emersi → lihat dimikroskop
Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.
Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau negrosin.pewarna asam memiliki negatif charge kromogen,tidak akan menembus atau berpenetrasi ke dalam sel karena negative charge pada permukaan bakteri. oleh karena itu, sel tidak berwarna mudah dilihat dengan latar belakang berwarna.
Pewarnaan merupakan suatu tahap dalam mikroteknik untuk mempertajamatau memperjelas berbagai elemen jaringan, terutama sel-seknya, sehingga dapatdibedakan dan ditelaah dengan mikroskop.tanpa pewarnaan, jaringan akantransparan sehingga sulit untuk diamati.Pewarnaan akan memperjelas rinci suatu jaringan sehinnga mudah untuk dipelajari. Pewarnaan dibedakan antara non vital dengan vitala. Pewarnaan non vital, pewarnaan dilakukan setelah jaringan dimatikan melaluifiksasi. Teknik ini merupakan teknik dan cara yang paling lazim digunakan,terutama untuk pekerjaan rutin sehari-hari, terutama pembuatan preparat/sediaan praktikum bagi mahasiswa. b. Pewarnaan vital, maka proses pewarnaan dilakukan selagi jaringan/sel masihdalam keadaan hidup. Sel-sel yang masih hidup tersebut diharapkan mampu untuk menyerap warna maupun mengikat/memfagosit partikel-partikel zat warna.Dengan demikian zat warna yang hendaknya yang tidak bersifat toksik bagi sel-sel tersebut. Sebagai contoh, tinta china dan lithium carmine secara umumdigunakan untuk mengamati penyebaran sifat sel-sel RES, karena sel-sel tersebutmampu memfagosit zat warna.c. Pewarnaan supra-vital diharapkan pada hasil kultur sel dan jaringan.
Dalam arti yang sangat luas, zat warna mencakup bahan organic dan bahananorganik, yang mengadakan ikatan dengan jaringan lebih jelas untuk diamati.Ditinjau dari berbagai segi, maka zat warna dapat kita bedakan atau kelompokan pada kategori-kategori tertentu
V. Mounting
Merupakan proses akhir dari pembuatan preparat metoda parafin. Sebelum ditutup secara permanen maka sebaiknya jaringan dilihat pada mikroskop apakah jaringan tersebut sudah dapat diamati dengan baik atau tidak. Pada mounting tutup dengan canada balsem dan gelas penutup. Hindari terbentuk gelembung udara, kemudian beri label dan diamati kembali dibawah mikroskop.
Pada contoh praktikum ini pembuatan preparat hewan yang digunakan adalah burung dara yang dapat kita lihat langkah-langkah didalam pembuatan preparat hewan adalah sebagai berikut:
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada pembuatan preparat hewan:
Botol film
Pinset
Skalpel
Mikrotom
Vakum
Kotak kertas kalender
Skalpel
Mikrotom
Vakum
Kotak kertas kalender
Balok
Mikroskop
Kaca objek
Oven
Hotplate
Hotplate
Bahan yang digunakan pada pembuatan preparat hewan:
Jaringan pada Burung Dara
FAA
Alkohol, dengan berbagai konsentrasi
Alkohol, dengan berbagai konsentrasi
Xilol
Parafin lunak dan keras
mayers albumin
Hematoksilin
Eosin
Safranin
Fastgreen
Pembuatan Preparat Hewan
1. Hewan percobaan (burung) dibius dengan menggunakan eter dan diambil organ-organ dalamnya, seperti jantung, ginjal, lambung, hati, usus, testes, paru-paru dll. Potong organ-organ tersebut dengan ukuran 0,5cm. Organ-organ yang diambil kemudian langsung dimasukan ke dalam larutan fiksasi (FAA) sebanyak 15 menit sebanyak 3X.
2. Dilakukan dehidrasi dengan direndam dalam alcohol 30, 40%, 50%, 70%, 80%, 90%, alcohol absolute. Masing-masing selama 60 menit,kecuali alkohol 70% boleh dimalamkan.
3. Dimasukan ke dalam Alkohol 100%:Xilol (1:1) selama 1 jam sebagai perantara sebelum proses penjernihan
4. Sisa alcohol dijernihkan dengan proses clearing, yaitu xilol 1 jam
5. Dilakukan tahapan perantara sebelum infiltrasi yaitu perendaman di dalam larutan Xilol : paraffin (paraffin keras)(1:1) 1 jam di dalam oven
6. Dilakukan infiltrasi dengan paraffin keras 3 kali masing-masing 1 jam dalam oven. Pada paraffin ketiga boleh dimalamkan
7. Tahap selanjutnya adalah embedding atau penanaman, organ dimasukkan kedalam kotak
8. Parafin yang berisi objek dipotong seperti balik di tempel balok kayu untuk pegangan di mikrotom.
9. Selanjutnya ke proses sectioning atau pengirisan, setelah melalui pendiaman dalam blok paraffin
10. Selanjutnya dilakukan Afiksing (membentuk sayatan jaringan ke kaca objek yang diolesi dengan mayers albumin.
11. Setelah pengeringan dengan menggunakan hotplate yang sebelumnya telah diteteskan oleh xilol (disebut proses deparafinasi) mulai memasuki ke dalam proses staining/pewarnaan, dengan proses sebagai berikut, rendam preparasi ke dalam xilol:alcohol (1:1) selama 3 menit, selanjutnya dilakukan dehidrasi dengan alkohol 100%-90%-80%-70% masing-masing selama 3 menit lalu masukkan dalam air lalu dilakukan pewarnaan dengan hematoxillin selama 5-15 menit, kemudian bersihkan dengan air.
12. Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan eosin dengna cara sbb, setelah distaining dengan hematoxilin masukkan dalam alcohol 50%, 60%, 70%, 80%, masing-masing 3 menit, lalu dimasukkan ke dalam eosin 15-30 menit, dilanjutkan dengan alcohol (90%-100%)masing-masing 3 menit. Selanjutnya penjernihan dengan menggunakan xilol 5-15 menit serta dibersihkan
13. penyelesaian dengan ditutup pakai kaca penutup sebagai media pelekat
14. Amati preparat yang dibuat dengan menggunakan mikroskop
Hasil dan Pembahasan
Bahan yang digunakan untuk pembuatan preparat hewan adalah burung dara .Pembuatan preparat pada praktikum ini dilakukan dengan metode parafin. Metode ini dilakukan dengan beberapa tahap yang dilakukan secara berurutan dan terus-menerus, yaitu pembiusan (untuk hewan), collecting, fiksasi, aerasi, dehidrasi, clearing, infiltrasi, embedding, sectioning, afixing, deparafinasi dan pewarnaan. Metode ini digunakan karena hampir semua jaringan dapat disayat dengan metode ini.
Pada hasil dari pembuatan preparat hewan, yaitu pada hati, otak dan paru-paru hasil yang didapatkan kurang bagus. Sehingga masih tidak dapat dibedakan bagian-bagiannya. Kadang preparat yang dihasilkan kurang bagus. Jaringan kadang melipat sehiingga sulit diamati bagian-bagiannya. Hal ini dikarenakan pada proses pengirisan kurang berhasil dimana pita menggulung dan jaringan yang melekat pada parafin hanya sedikit. Warna jaringan yang pudar karena setelah perendaman di larutan pewarna terlalu lama dibiarkan di udara bebas. Hal lain yang sangat mungkin adalah pewarna kualitasnya sudah menurun atau terlalu lama. Jaringan yang teramati kadang rusak aatu terkoyak hal ini dapat dikarenakan pita sobek sehingga jaringan ikut rusak. Proses infiltrasi dengan xilol kurang maksimal sehingga jaringan rapuh (Affuwa, 2007).
Salah satu preparat hewan adalah hati. Hati adalah sebuah organ dalam vertebrata, termasuk manusia. Organ ini memainkan peran penting dalam metabolisme dan memiliki beberapa fungsi dalam tubuh termasuk penyimpanan glikogen, sintesis protein plasma, dan penetralan obat. Preparat yang lain adalah preparat otak dan paru-paru. Pada otak sebagiannya terdiri atas sel syaraf. (Jurusan Biologi Fakultas Sains dan Teknologi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta).
Salah satu preparat hewan adalah hati. Hati adalah sebuah organ dalam vertebrata, termasuk manusia. Organ ini memainkan peran penting dalam metabolisme dan memiliki beberapa fungsi dalam tubuh termasuk penyimpanan glikogen, sintesis protein plasma, dan penetralan obat. Preparat yang lain adalah preparat otak dan paru-paru. Pada otak sebagiannya terdiri atas sel syaraf. (Jurusan Biologi Fakultas Sains dan Teknologi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta).
DAFTAR PUSTAKA
__________________ . Pembuatan Preparat Jaringan Hewan Dengan Metode Parafin. Lap.prak mikroteknik Universitas Brawijaya. http://cyber-biology.blogspot.com. Di akses tanggal 29 Desember 2008 jam 14.17
Buckle.2007 Mikrobiologi Terapan. Universitas Gajah Mada: Yogyakarta
Dasumiati, 2008. Diktat Kuliah Mikroteknik. Prodi Biologi Fak.Sains dan Teknologi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Dwidjoseputro. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan: Jakarta
Hadiutomo. 1990. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta: Erlangga
Pelezar,chan. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press: Jakarta
Rusdimin.2003. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta: Pt Gramedia
Suriawiria, unus. 1999. Pengantar Mikrobiologi Umum. Bandung: Aksara
Tryana, S.T. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang: Djambatan
Widjoseputro, D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan
Tidak ada komentar:
Posting Komentar