Catattan-aku Agrobacterium Tumefaciens

Agrobacterium Tumefaciens

Agrobacterium Tumefaciens adalah golongan bakteri pathogen yang banyak dipakai oleh pemuliaan tanaman didalam merekayasa genetika tanaman untuk membawa (sebagai vektor) memasukkan gen asing ketanaman target untuk menciptakan tanaman transgenic ( tanaman yang telah disisipi gen asing kedalam jaringan tanaman tersebut).Bakteri Agrobacterium Tumefaciens memiliki plasmid Ti(tumor induksi)yang secara alami dapat menginfeksi tanaman dikotiledon melalui bagian tanaman yang terluka.Bakteri ini tergolong kedalam gram negative(bakteri yang tidak dapat mempertahankan zat warna Kristal violet sewaktu proses pewarnaan gram,sehingga akan bewarna merah ketika diamati dengan mikroskop).

Plasmid Ti

merupakan vektor (pembawa) alamiah yang digunakan untuk mentransfer DNA ke dalam sel tanaman.Bakteri Agrobacterium Tumefaciens merupakan salah satu jenis bakteri yang membawa plasmid Ti yang dapat menyebabkan tumor pada tanaman yang disebut crown gall, terutama tanaman dikotil.Pada sebagian besar plasmid Ti, terdapat lima kompleks gen, yaitu T-DNA (bagian yang ditransfer dan menyatu dengan genom tanaman), gen virulen (vir) yang terdiri dari 50 kilo-basa untuk mengatur proses transfer T-DNA ke dalam DNA tanaman, gen tra/trb yang mengatur perpindahan plasmid Ti antarbakteri, bagian yang mengatur sistem replikasi plasmid, dan bagian gen yang menyandikan molekul opin.Molekul opin ini akan dihasilkan oleh jaringan tanaman yang terinfeksi bakteri pembawa plasmid Ti.

Secara umum proses pemilihan dan penyisipan DNA target ke plasmid Ti untuk menciptakan DNA rekombinan yang nantinya akan ditransfer ketanaman sasaran melalui bakteri Agrobacterium Tumefaciens ada beberapa hal yang harus diketahui,meliputi:

1.Teknologi DNA Rekombinan; Kumpulan teknik atau metoda yang digunakan untuk mengkombinasikan gen-gen secara buatan. Diantaranya:

-Teknik untuk mengisolasi DNA.

-Teknik untuk memotong DNA

-Teknik untuk menggabung atau menyambung DNA

-Teknik untuk memasukkan DNA kedalam sel hidup sehingga DNA rekombinan dapat bereplikasi dan dapat diekspresikan.

DNA dapat masuk kedalam sel bakteri melalui 3 cara:

a.Konjugasi

b.Transformasi,dan

c.Transduksi

a. Konjugasi

Perpindahan DNA dari satu sel (sel donor) kedalam sel bakteri lainnya (sel resipien) melalui kontak fisik antara kedua sel

b. Transformasi

pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan disekelilingnya.

c. Transduksi

cara pemindahan DNA dari satu sel kedalam sel lainnya melalui perantaraan fage.

Perangkat utama yang digunakan pada pembentukan DNA rekombinan yaitu:

•plasmid (tempat menempelnya gen target)

•enzim restriksi (pemotong DNA)

•DNA ligase (menyambung DNA)

•bakteri (sebagai vector menuju tanaman sasaran)

2. Plasmid:

-Terdapat pada bakteri (Agrobacterium Tumefaciens),plasmid Ti(tumor induksi)

-DNA selain kromosom

-Berbentuk sirkuler

-Umumnya berukuran kecil (lebih kecil dari ukuran kromosom bakteri)

-Jenis, jumlah, dan ukurannya bervariasi antar sel dan antar jenis bakteri

Fungsi Plasmid pada pembentukan DNA rekombinan:

a.digunakan sebagai vector untuk mengklonkan fragmen DNA atau mengubah sifat bakteri sesuai apa yang kita inginkan.

b. untuk memperbanyak gen (copy gene) yang telah disisipkan dengan bantuan sel bakteri

potong plasmid pada bagian yang telah ditentukan dengan menggunakan enzim retriksi,kemudian masukkan/sisipkan Dna target ke plasmid dan sambung dengan menggunakan enzim legase.Setelah itu, masukkan plasmid yang sudah disisipi gen target(gen asing)tersebut kedalam bakteri untuk diperbanyak.Setelah bakteri dimasukkan plasmid yang membawa gen target,bakteri A.tumefasiens ini diletakkan pada media nutrient agar yang mengandung ampicilin dan di inkubasi dengan suhu 37 derajat celcius.Tujuan peletakkan bakteri tersebut pada media nutrient agar yang mengandung ampicilin adalah untuk menyeleksi antara bakteri yang mengandung plasmid rekombinan dengan bakteri yang non plasmid rekombinan,dimana nantinya bakteri yang tak mengandung plasmid yang telah disisipkan gen target akan mati,sedangkan plasmid yang mengandung/ yang disisipi gen target akan tetap bertahan(plasmid rekombinan).Disini juga nanti bakteri yang bertahan tersebut akan memperbanyak diri sehingga nantinya akan didapatkan banyak sekali bakteri yang telah mengandung plasmid rekombinan.Nantinya bakteri yang mengandung plasmid rekombinan ini akan dipilih beberapa saja,sebab apabila menggunakan banyak bakteri nantinya pada saat melakukan pembunuhan bakteri akan sulit dilakukan,namun untuk tingkat keberhasilan mungkin akan tinggi (karena bakteri hanya sebagai vector yang kita harapkan hanya membawa gen target ke tanaman,setelah itu bakteri dibunuh).Membunuh bakteri nantinya dapat dilakukan dengan antibiotic yaitu sekotaksin,dimana dengan pemberian larutan sekotaksin ini bakteri akan mati namun tidak merusak gen target yang kita sisipkan (yang perlu diperhatikan adalah bahwa antibiotic tak tahan terhadap suhu panas).

3.Tahap-tahap menyisipkan DNA rekombinan pada tanaman sasaran:

Bakteri Agrobacterium tumefaciens untuk menyisipkan gen kedalam genom tanaman:  
Agrobacterium tumefaciens strain liar (galur alami) memiliki plasmid Ti. Pada plasmid Ti terdapat T-DNA yang mengandung gen penyebab tumor. Pada waktu menginfeksi tanaman, Agrobacterium tumefaciens menyisipkan T-DNA kedalam kromosom sel tanaman sehingga sel-sel tanaman yang terinfeksi membentuk tumor.Gen yang diinginkan dimasukkan kedalam sel tanaman dengan cara menitipkannya (menyisipkan) pada T-DNA. Agrobacterium yang digunakan untuk menginfeksi sel  tanaman adalah Agrobacterium yang sudah tidak pathogen.

DAFTAR PUSTAKA

-          (Inggris) Gustavo A. de la Riva, Joel González-Cabrera, Roberto Vázquez-Padrón, Camilo Ayra-Pardo (1998). "Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation". EJB Electronic Journal of Biotechnology 1 (3). doi:10.2225/vol1-issue3-fulltext-1. http://www. Ejbiotechnology.info/content/vol1/issue3/full/1/.