MIKROTEKNIK
Mikroteknik
merupakan ilmu atau seni mempersiapkan organ, jaringan atau bagian
jaringan untuk dapat diamati dan ditelaah. Penelaahan umumnya dilakukan
dengan bantuan mikroskop,
karena struktur jaringan secara terperinci pada galibnya terlalu kecil
untuk dapat dilihat dengan mata telanjang. Ruang lingkup yang mencakup
materi mikroteknik dapat diperoleh dari sejumlah definisi dan
peristilahan yang bisa dipakai, hanya saja sebaiknya kita mencamkan
dalam pikiran kita bahwa suatu spesimen mikroteknik dapat merupakan
sebagian atau seluruhan dari struktur yang ditetapkan. Selain dilekapkan
dengan kaca preparat, spesimen tadi umumnya dilindungi dengan kaca
penutup, yaitu sepotong kaca yang sangat tipis ataupun plastik yang
tembus pandang yang direkatkan diatas spesimen tersebut (Gunarso, 1989).
Sedangkan menurut Amar (2008) Mikroteknik adalah ilmu yang akan
mempelajari metode/prosedur pembuatan preparat mikroskopik.
Mikroteknik
merupakan teknik pembuatan sediaan atau preparat secara mikroskopis,
tentunya pendekatan teoritis tidaklah memadai untuk memahami secara
menyeluruh mengenai Mikroteknik, sebab yang namanya teknik lebih
menekankan pemahaman pada wilayah aplikatifnya meskipun pada dasarnya
landasan teoritis juga diperlukan dalam rangka memberikan beberapa
petunjuk yang harus dilalui agar proses pembuatan sediaan sesuai dengan
prosedural kerja dan alasan penggunaan ataupun pemilihan bahan yang akan
digunakan dalam pembuatan sediaan Mikroskopis.
Organ
adalah susunan dari bagian organisme, yang tujuannya melakukan fungsi
tertentu ataupun kesatuan yang erat kaitannya. Dengan demikian pembuluh
darah adalah organ yang fungsinya membawa atau mengalirkan darah. Hati
adalah organ yang mempunyai banyak fungsi, akan tetapi sebagai kesatuan
fungsi maka hati ini erat kaitannya dengan pencernaan dan asimilasi
makanan (Gunarso, 1989).
Jaringan
adalah kumpulan sel yang mempunyai fungsi tertentu yang khas bagi
perkembangannya. Sebagai contoh jaringan epitelia dapat terdiri dari
satu atau beberapa lapisan sel yang telah berkembang dan membantuk
lapisan penutup, jenis jaringan lainnya, jaringan otot terdiri dari
sel-sel yang reka membentuk otot (Gunarso, 1989).
Sel adalah bagian yang merupakan penyusun dasar suatu jaringan, dan pada kenyataannnya merupakan bagian dari semua makhluk hidup. Suatu sel dapat merupakan organisme yang lengkap, ataupun sejumlah sel dapat bergabung membentuk suatu jaringan, kombinasi penyusunnya membentuk orga-organ. Bentu-bentuk kehidupan berderajat tinggi sekalipun dimulai dari satu sel. Bila suatu organisme hanya teridiri dari satu sel, maka dinamakan Organisme Uniseluler. Sedangkan yang terbentuk oleh kumpulan sel-sel yang berbeda fungsinya dinamakan Organisme Multiseluler (Gunarso, 1989).
Sel adalah bagian yang merupakan penyusun dasar suatu jaringan, dan pada kenyataannnya merupakan bagian dari semua makhluk hidup. Suatu sel dapat merupakan organisme yang lengkap, ataupun sejumlah sel dapat bergabung membentuk suatu jaringan, kombinasi penyusunnya membentuk orga-organ. Bentu-bentuk kehidupan berderajat tinggi sekalipun dimulai dari satu sel. Bila suatu organisme hanya teridiri dari satu sel, maka dinamakan Organisme Uniseluler. Sedangkan yang terbentuk oleh kumpulan sel-sel yang berbeda fungsinya dinamakan Organisme Multiseluler (Gunarso, 1989).
Metoda-metoda didalam Mikroteknik yang umum digunakan :
1. Sediaan utuh (Whole mounts)
2. Sediaan irisan (sectioning)
3. Sediaan uraian (teasing)
4. Sediaan ulasan (smearing)
Selain itu masih ada pula dikenal beberapa metoda lain seperti :
1. Sediaan rentang (spreading preparation)
2. Sediaan gosok – sediaan remasan (squash)
3. Sediaan supravital
Metoda Sediaan Utuh (Whole Mounts)
Dengan
metoda ini dipersiapkan sediaan yang terdiri atas keseluruhan organisme
(baik hewan maupun tumhuhan) secara utuh. spesimen kultur, organ,
maupun bagian organ, embrio, sel telur, spermatozoa ,potongan
syaraf,pembuluh darah, jenis-jenis selaput tipis dan sebagainya. Melalui
metoda ini diusahakan agar kita mendapat kesan bentuk aslinya dengan
mempertahankan format-format taga dimensinya. Yang menjadi pembatas
adalah faktor ukuran, ketabalan, serta tingkat transparansi sediaan yang
kita buat tersebut yang berkaitan dengan faktor pembesaran pengamatan
melalui mikroskop nantinya. Sediaan dengan ketebalan 2 mm dan transparan
akan memungkinkan untuk diamati sampai tingkat perbasaran tidak lebih
dari 30 kali. Sediaan dengan ketebalan 0,5 mm mungkin hanya akan
mencapai tingkat perbesaran 100 kali. Sediaan permanen dengan ketebalan
0,2 mm atau lebih yang telah di dehidrasidan diberi media pelekap
memerluka adanya suatu penunjang gelas penutup agar spesimen tidak
menjadi rusak dan gelas penutupnya sendiri tidak pecah karena proses
pengeringan serta pengkerutan media tersebuut. Belakangan ini umum pula
digunakan tabung plastik yang dipotong-potong secara melintang hingga
dihasilkan cincin-cincin penunjang dengan ketebalan yang sesuai dengan
tinggi serta ketebalan speimen. Tepi tempat pemotongan sebaiknya
dihaluskan dengan mengunakan kerrtas amplas (Gunarso, 1989).
Menurut
(Joyner, 2008 dalam zaifbio 2010) Whole mounth merupakan metode
pembuatan preparat yang nantinya akan diamati dengan mikroskop tanpa
didahului adanya proses pemotongan. Jadi pada metode ini, preparat yang
diamati adalah preparat yang utuh baik itu berupa sel, jaringan, organ
maupun individu. Gambar yang dihasilkan oleh preparat whole mounth ini
terlihat dalam wujud utuhnya seperti ketika organisme tersebut masih
hidup sehingga pengamatan yang dapat dilakukan hanya terbatas terhadap
morfologi secara umum saja. Metode pembuatan preparat yang digunakan
untuk pengamatan secara menyeluruh, artinya mempelajari struktur
vegetatif dan reproduktifnya tanpa melakukan penyayatan terhadap tanaman
tersebut karena metode ini menggunakan semua bagian tanaman sebagai
preparatnya. Tentu saja tanaman yang diamati haruslah berukuran kecil
sehingga dapat termuat pada objek glass. Sedangkan pada tanaman yang
agak besar bisa dilakukan pemangkasan agar menjadi lebih rapi dan kecil.
Metode whole mounth mempunyai kelebihan dan kelemahan masing-masing.
Kelebihan metode ini adalah dapat mengamati seluruh bagian tanaman
dengan jelas tiap bagian-bagiannya. Sedangkan kelemahannya adalah metode
ini hanya bisa dilakukan pada tanaman dengan ukuran yang kecil saja
tidak bisa tanaman yang besar sehingga metode ini perlu terus
dikembangkan dengan melakukan bebagai percobaan (Gunarso, 1989).
Metoda Sediaan Irisan (Sectioning)
Metoda Sediaan Irisan (Sectioning)
Cara
pengerjaan melalui irisan atau sayatan ini dianggap sebagai teknik
rutin ataupun teknik bagi penyiapan spesimen histologi amaupun patologi.
Tebal tipisnya sayatan bergantung pada pengalaman serta tujuan
penyiapan spesimen. Tebal sayatan yang umum berkisar antara 6-15 mikron
(1 mikron = 0,001 mm). Ukura sayatan juga sangat bervariasi, mulai dari
saytaan pembuluh darah yang sangat kecil hingga sayatan otak. Ukuran
sayatan biasanya terbatas pada ukuran panjang lebar 2x3 cm karena ukuran
yang demikian paling sesuai untuk direkapkan pada kaca preparat yang
umum digunakan. Tentu saja ukuran spesimen yang cukup kecil akan
mengjasilkan sayatan juga juga jauh lebih kecil dari ukuran sayatan
tersebut.
Pengirisan
atau penyayatan umumnya dilakukan dengan bantuan mikrotom, walau
seringkali dilakukan penyayatan dengan tangan saja untuk jenis spesimen
seperti tulang, gigi ataupun benda-benda fosil seringkali diperlukan
gergaji untuk memotongnya. Mikrotom adalah jenis mesin khusus dirancang
dan dipasarkan untuk tujuan mikroteknik. Mesin tersebut dirancang
sedemikian rupa sehingga mampu untuk melakukan penyayatan sesuatu
spesimen dengan ketebalan yang sama atau paling kurang mendekati sama
(Gunarso, 1989).
Metoda Sediaan Uraian (Teasing Preparations)
Pengertian
teasing adalah menguaraikan. Untuk dapat memisahkan komponen suatu
jenis jaringan maupun organ tisu atau jaringan diuraikan dengan
menggunakan jarum penguraian. Dengan demikian pengertian teasng ini
berarti juga pembedahan dalam skala kecil. Tingkatnya pada pembedahan
biasa dan pembedahan mikro yang dilakukan dengan menggunakan jarum
pengurai. Teasing ini dilakukan pada jenis sediaan segar yang telah
difiksasi dan mengalami pewarnaan
Secara umum jenis tisu yang bisa ditelaah melalui metode ulas ini adalah darah, limfa, cairan sum-sum tulang belakang, semen janan, sediaan air seni, serta beberapa lainnya. Masing-masing biasanya memerlukan teknik perlakuan tersendiri dalam melakukan pengulasa atau penyebaran pada kaca preparat. Untuk jenis cairan yang mengandung suspensi yang tinggi densitasnya umumnya dicairkan dengan air atau serum darah dengan perbandingan 1 : 5 atau 1 : 10 (Gunarso, 1989).
Metoda Sediaan Rentang
Pada
metoda ini preparat belum difiksasi, diperlakukan sedemikian rupa
sehingga disamping jelas juga mendekati keadaan aslinya dengan melalui
perentangan. Jenis bahan siapan yang umum direntang saat difiksasi
adalah otot, syaraf, jenis jaringan tipis (selaput yang membungkus
jantung ,hate dan lain-lain) (Gunarso,1989).
Metoda Sediaan Gosok
Jenis
jaringan yang keras sifatnya, seperti tulang, gigi, kuku dan beberapa
lainnya mungkin sekali sangat sukar untuk dibuat sediaan sayatan
(kecuali bila mengalami berbagai perlakuan khusus sebelumnya). Untuk
mengatasi hal diatas tadi, maka umum juga dibuat sediaan dengan metoda
gosok. Tulang misalkan tulang paha, terlebih dahulu dipotong-potong
hingga ukuran beberapa mili hingga 1 – 2 cm. Potongan tersebut kemudian
digosok pada batu hingga cukup tipis untuk dapat diamati pada mikroskop
(Gunarso, 1989).
Metoda Sediaan Supravital
Selain
jenis-jenis metoda yang dimanfaatkan materi yang mengalami matian dan
fiksasi. Untuk pengamatan sel-sel darah yang masih hidup umumnya
digunakan zat warna vital seperti Yanus green atau Neutral red, karena
sel darah mempunyai kemampuan untuk menghisap zat warna pada konsentrasi
yang sesuai. Bila kedua zat warna tersebut dipakai secara bersama-sama
maka memungkinkan kita untuk mengamati mitokondria. Hanya saja akan
terjadi perubahan yang sangat cepat pada sel, karena sel dapat mati oleh
kedua warna tadi secara bersamaan (Gunarso, 1989).Metoda Sediaan Supravital
Contoh penyiapan sediaan supervital darah adalah :
1. Satu tetes darah diteteskan pada kaca preparat
2. Teteskan pula 1 tetes zat warna (missal yanus green) dengan konsentrasi 0,25 dalam garam fisiologis3. Tutup dengan kaca penutup
4. Biarkan selama 5 menit
5. Beri lak petrolatum sekeliling tepi kaca penutup. (Lasantha, 2010)
Metoda Sediaan Remasan (Squash)
Metode
remasan banyak dikakukan untuk penyaiapan pengamatan kromosom baik
hewan maupun tumbuhan. Dengan metoda ini bahan diremas atau dihancurkan
sehingga masing-masing sel akan terlepas yang memudahkan pengamatan
selanjutnya. Jadi tujuan peremasan ini bukan berarti menghancurkan
sel-selnya, tapi masing-masing sel bebas terlepas satu sama lain dengan
tetap dipertahankan bentuk aslinya
Tahapan –tahapan dalam mikroteknik
1. Fiksasi (fixation)
Fiksasi
bisa dengan kimiawi yaitu menggunakan senyawa formaldehide /
glutardehide dan mekanik dengan cara difreezing atau boiling.Tujuan
fixation adalah untuk mempertahankan bentuk sel atau jaringan seperti
jaringan aslinya , serta untuk mencegah rusaknya sampel akibat autolisis
atau karena bakteri dekomposisi (bakteri pengurai).
2. Dehydration dan clearing
Menggunakan
alkohol yang diberikan secara bertingkat dari konsentrasi tinggi ke
konsentrasi rendah. Tujuan dari dehidrasi yaitu untuk menghilangkan
sisa-sisa cairan/air yang ada pada sampel sehingga saat proses
selanjutnya tidak terbentuk es di dalam sampel. Setelah proses
dehydration di clearing dengan larutan xyline untuk membersihkan
sisa-sisa alkohol.
3. Embedding
Sampel
dikeraskan dengan menggunakan lilin/waxes, resin untuk membentuk blok
parapin. Dikeraskan supaya mudah untuk dilakukan pemotongan sampel.
4. Sectioning
Sampel
dipotong dengan mengunakan alat pemotong misalnya microtome. Ataupun
jika sebelumnya sampel difiksasi dengan cara freezing bisa selanjutnya
dipotong dengan metode cryostat (pemotongan dengan dibekukan).
5. Staining
Selanjut
sampel diwarnai, biasanya dengan pewarnaan hymatoksilin-eosin atau dari
derivatnya yang lain yang biasa digunakan. Pewarnaan tersebut untuk
mewarnai inti sel dan sitoplasmanya.
6. Mouthing
Setelah
diwarnai selanjutnya sampel bisa langsung diamati dibawah mikroskop
atau di proses mouthing sampel dengan tujuan untuk mempertahankan sampel
jika disimpal lama, pewarnaannya dan sampelnya tidak rusak. Biasanya
menggunakan canada balsem.
I.Fiksasi
Tujuan
utama fiksas adalah memberikan perlakuan tertentu terhadap elemen-lemen
jaringan, terutama inti sel atau nukleinya, sehingga dapat diwetkan
dalam kondisis yang sedikit banyak mendekati keadaan aslinya. Selain
itu, fiksasi juga mencegah terjadinya kerusakan jaringan yang
disebabakan oleh mikroorganisme maupun perusakan oleh enzim yang
terkandung dalam jaringan itu sendiri, yang dikenal dengan autolisis.
Dengan kata lain fiksasi bertujuan:
- Mematikan (menghentikanØ proses-proses metabolisme) jaringan dengan cepat sehingga keadaannya sedikit banyak mendekati keadaan aslinya.
- Mencegah autolisis
- Menaikkan daya pewarnaan karena adanya bahan-bahan keras yang merupakan komponen cairan fiksatif.
Pada garis besarnya berdasarkan komposisi bahannya suatu fiksatif dapat dikelompok kan menjadi Fiksatif tunggal. Hanya menggunakan satu bahan kimia umum dalam bentuk larutan
Contoh:
formalin ,alcohol ,asam asetat dan asam pikrat. Umumnya kurang memenuhi
persyaratan sebagai fiksatif yang baik, terutama bagi tujuan
mikroteknik. Masih umum digunakan untuk tujuan anatomi maupun
histopatologi terutama fiksatif formalin.
Fiksatif majemuk
Umumnya
berupa campuran dari beberapa fiksatif tunggal Disusun dengan formula
agar dapat diperoleh sesuai keinginan dan tujuan.biasanya fiksatif
campuran ini dituliskan sesuai dengan nama penemu formulanya Banyak
sekali fiksatif campuran yang ada,
contoh : larutan Bouin,larutan FAA, larutan glison, dan lain sebagainya
Fiksatif
berfungsi untuk menghentikan metabolisme secara cepat, mengawetkan
komponen sitologis dan histologis, memperkeras tekstur yang rapuh, dan
mewarnai jaringan sehingga bagian-bagiannya
dapat diketahui. Faktor-faktor yang berperan dalam fiksasi adalah buffer
(pH), suhu yang rendah, ketebalan irisan, perubahan volume,osmolalitas
pada larutan fiksatif, konsentrasi, dan waktu fiksasi.Dehidrasi memiliki
fungsi menghilangkan air dalam jaringan. Bahan yangdigunakan untuk
dehidrasi harus mampu menggantikan fungsi air. Dehidrasi yang baik
dilakukan secara bertahap yaitu mulai dari konsentrasi 70% sesuai
dengan pelarut Bouin formol kemudian berturut-turut ke dalam alkohol
80%, 90%, 96%dan alkohol absolut. Pada setiap konsentrasi dilakukan
pengulangan 3 kali.Metode paraffin merupakan cara dalam pembuatan
sediaan denganmenggunakan paraffin sebagai media embedding (penanaman).
II. Dehydration dan clearing (penjernihan)
Clearing atau
dealkoholisasi ini dapat menggunakan aceton, benzol,toluol, dan xilol.
Clearing dapat dilakukan selama 24 jam.Mikrotom adalah mesin untuk
mengiris spesimen biologi menjadi bagianyang sangat tipis untuk
pemeriksaan mikroskop. Beberapa mikrotommenggunakan pisau baja dan
digunakan untuk mempersiapkan sayatan jaringan hewan atau tumbuhan dalam
histologi (Wikipedia). Jenis-jenis mikrotom yang bisa dipakai
pada mikroteknik adalah:1. Rocking microtom, cara kerjanya seperti
mengatam kayu, biasanya untuk organ-organ keras seperti kayu2. Rotary
microtom atau mikrotom putar, cara kerjanya dengan di putar yang
akanmengerakan objek maju dan naik turun, sementara pisaunya tetap.
Mikrotom ini biasanya dipakai dalam mikroteknik metode paraffin3.
Sliding microtom atau mikrotom sorong, dimana jaringan tetap posisinya
dan pisau yang bergerak maju dan mundur. Mikrotom ini sering digunakan
padamikroteknik metode paraffin, walau umumnya digunakan pada
penyayayan jaringan yang di tanam dalam celloidin. Biasanya digunakan
pada objek-objek yang keras.4. Freezing microtom atau mikrotom beku,
sering digunakan untuk penyayatan jaringan yang tidak ditanam dalam
paraffin maupun dalam celloidin, jadi jaringanyang disayat adalah
jaringan yang tidak di tanam tetapi dibekukan denganmemakai gas CO2.
Keuntungan dari mikrotom ini adalah waktu yang dipakailebih pendek,
karena langsung disayat setelah proses fiksasi. Kerugiannya adalah bila
temperature kamar tinggi, objek menjadi lunak sehingga sulit dipotong.
Hal-hal yang harus diperhatikan dalam proses penyayatan ini adalah:o
Mikrotom harus seberat mungkino Meja tempat mikrotom harus stabilo Pisau
harus cocok dengan mikrotomo Posisi pisau harus stabilo Mata bisau
harus tajam, bersih dan suhunya harus sama dengan balok jaringanyang
akan disayat.